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          測定蛋白含量都有哪些方法?

          發布時間: 2022-11-01  點擊次數: 281次

          蛋白的含量的測定方法主要有紫外分光光度法、Lowry法、BCA法等。



          紫外分光光度法


          原理

          蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環在275~280mm有一紫外吸收峰。在一定濃度范圍內,其在280mm的吸光度與蛋白濃度成正比。


          方法

          取適量蛋白溶液(約3.5ml),置于光徑為1cm的石英比色杯、用與溶解蛋白的緩沖液相同的緩沖液為對照,在280mm波長處測定吸光度,吸光度為1.0的蛋白溶液,蛋白濃度約為1.0mg/ml。當溶液中含少量核酸時,應同時測定260nm波長處的吸光度,以下式估算蛋白濃度:蛋白濃度(mg/ml)=1.55A280-0.75A260。該測定方法誤差較大,有紫外光吸收的物質(如核酸)干擾大。


          材料和儀器

          (1)4%Na?CO3;(2)0.2mol/LNaOH;(3)1%CuSO4;(4)2%酒石酸鈉。試劑A:使用前,將(1)(2)(3)(4)試劑以50:50:1:1的比例混合均勻,當天使用。試劑B:酚試劑。



          Lorry法

          Lowry法靈敏度較高,線性范圍為20~100ug/ml。該方法干擾因素主要有:高濃度的胍鹽、尿素等變性劑,Triton、Tween等去垢劑,EIDTA等整合劑,以及Tris、甘氨酸等等。


          材料和儀器

          材料:(1)4%Na?CO3;(2)0.2mol/LNaOH;(3)1%CuSO4;(4)2%酒石酸鈉。試劑A:使用前,將(1)(2)(3)(4)試劑以50:50:1:1的比例混合均勻,當天使用。試劑B:酚試劑。

          儀器:分光光度計。


          操作步驟

          (1)準確稱取10mg標準蛋白(常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白)加蒸餾水溶解定容至100ml。

          (2)取6支試管分別編為0~5號,分別加入步驟(1)制備的標準蛋白溶液0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40ml,并都用蒸餾水補足至0.4ml。

          (3)各試管加入試劑A 2ml,混勻,室溫放置10分鐘。

          (4)各試管加入試劑B 0.2ml,立即混勻,室溫或37℃水浴中,保溫30分鐘。

          (5)在分光光度計上,以0號為參比,測定各管樣品在750mm的吸光度值。

          (6)以蛋白濃度為橫座標,吸光度為縱座標繪制標準曲線,或作直線回歸。

          (7)取樣品溶液0.4ml,按步驟(1)~(5)測定,將測得的吸光度值代入上述標準曲線,計算蛋白濃度。


          注意:如果樣品濃度過高,可用蒸餾水作適當稀釋。



          BCA法


          BCA法的優點是抗干擾能力強,其原理是:在堿性溶液中,蛋白將二價銅還原成一價銅,后者與試劑中的BCA(二辛可酸,Bicinchoninic acid)形成一個在562mm處具有最大吸光度的紫色復合物,其吸光度與蛋白濃度成正比,線性范圍20~100ug/ml。


          材料和儀器

          試劑A:1%BCA二鈉鹽,2%碳酸鈉,0.16%酒石酸鈉,0.4%氫氧化鈉和0.95%碳酸氫鈉。用50%NaOH或碳酸氫鈉調pH11.25。


          試劑B:4%硫酸銅

          工作液:100倍體積試劑A與2倍體積試劑B混合。


          操作步驟

          (1)準確稱取10mg標準蛋白(常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白)加蒸餾水溶解定容至100ml。

          (2)取6支試管分別編為0~5號,分別加入步驟1制備的標準蛋白溶液0、20、40、60、80、100 ul,并都用蒸餾水補足至100ul。

          (3)各試管加入工作液2ml,混勻,37℃水浴保溫30分鐘。

          (4)在分光光度計上,以0號為參比,測定各管樣品在562mm的吸光度值。

          (5)以蛋白濃度為橫座標,吸光度為縱座標繪制標準曲線,或作直線回歸:

          (6)取樣品溶液100 ul,按步驟1~4測定,將測得的吸光度值代入上述標準曲線,計算蛋白濃度。


          注意:如果樣品濃度過高,可用蒸餾水作適當稀釋。


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