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          如何才能把細胞培養好?

          發布時間: 2022-11-01  點擊次數: 277次


          一、細胞培養的基本概念

          (1)基本概念


          細胞培養:狹義的細胞培養主要是指分離(散)細胞培養,廣義的細胞培養還包括單(個)細胞培養又稱克?。╟lone),是指單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。

           

          原代培養:即第一次培養,指將培養物放在體外生長環境中持續培養,中途不分割培養物的培養過程。

           

          傳代:原代培養成功后,隨著培養時間的延長和細胞不斷分裂,一則細胞之間相互接觸發生接觸性抑制,生長速度減慢甚至停止;另一方面因營養物不足和代謝物積累不利于生長或發生中毒。需要將培養物分割成小的部分,重新接種到另外的培養器皿(瓶)內,再進行培養。這個過程稱為傳代或者再培養。

           

          細胞系:原代培養物經首傳代成功后,即成細胞系。如細胞系不能繼續傳代或傳代數有限,稱為有限細胞系,它由原代培養中的許多細胞系列組成。如細胞系可連續傳代,則稱為連續細胞系,即已建成的細胞系。

           

          細胞株:通過篩選或克隆化,且有特殊性質或特異標記的細胞。這些特性在以后的培養中必須持續存在。這些特性包括具有一定的標記染色體,對某種病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。 



          二、細胞的生長

          (1)生長方式

           

          貼附生長:必須貼附于支持物表面才能生長。

          懸浮生長:于懸浮狀態下即可生長,不需要貼附于支持物表面。



          (2)生長過程


          游離期:細胞接種后在培養液中呈懸浮狀態,也稱懸浮期。此時細胞質回縮,胞體呈圓球形。10min-4h。


          貼壁期:細胞附著于底物上,游離期結束。細胞株平均在10min-4h貼壁。底物:膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白(生長基質),這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上,懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養瓶涂有生長基質(化學合成的功能基團)。


          潛伏期:此時細胞有生長話動,而無細胞分裂。細胞株潛伏期般為6~24小時。


          對數生長期:細胞數隨時間變化成倍增長,活力最佳,最為適合進行實驗研究。


          停止期(平臺期):細胞長滿瓶壁后,細胞雖有活力但不再分裂,機制:接觸抑制、密度依賴性。


          (3)生長條件

          細胞的營養需,細胞的生存環境,溫度:37℃,O2,CO2:5%,pH:7.2-7.4,滲透壓,無污染,無毒。




          三、常用的器材與試劑

          (1)常用儀器

          超凈工作臺:為細胞操作提供無菌環境。紫外燈:紫外線消毒。主要用于培養室空氣、操作臺、塑料培養皿和培養板等表面消毒。


          濾器:過濾除菌:大多數培養用液,如人工合成培養基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。



          電熱干燥箱:干熱消毒(160℃,2h)。主要用干玻璃器皿消毒。


          壓力蒸汽消毒器:濕熱消毒,用途廣。


          CO2培養箱:CO2培養箱設定的條件:37℃,5%CO2。使用CO2培養箱培養細胞時應注意的問題:


          ①用螺旋口瓶培養細胞時,需將瓶蓋微松,以保證通氣。

          ②保持培養箱內空氣干凈。定期消毒(90℃,14h)。

          ③箱內火菌蒸餾水 3000ml 蒸餾水槽中以保持箱內濕度,避兔培養液蒸發。

           

          其它儀器:倒置顯微鏡,酶標儀,微孔板震蕩器,液氮罐,自動雙重純水蒸餾器,純水儀等。


          (2)常用耗材


          耗材:培養瓶,吸管,培養板,凍存管,酒精燈


          (3)常用試劑

          • 消化液

          胰蛋白酶:是一種黃白色粉末,用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制,常用的胰蛋白酶液濃度是0.25%。用濾器過濾除菌,如經費充??梢灾苯淤徺I已經配制好的胰酶,無需自己配制。


          胰蛋白酶作用機制:胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健,除去細胞間粘蛋白及糖蛋白,影響細胞骨架,從而使細胞分離。胰蛋白酶液濃度越高,作用越強,但超過一定限度會損傷細胞。


          胰蛋白酶液消化時間:2-10 min??捎煤迮囵B液終止其對細胞的消化作用。


          • 培養基

          培養基(培養液):是維持體外細胞生存和生長的溶液,分天然培養基和合成培養基。


          天然培養基:天然培養基有血清、血漿、和組織提取液(如雞胚和牛胚浸液)。優點:營養成分豐富,培養效果好。缺點:來源受限。成分復雜,影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析。易發生支原體污染。


          合成培養基:合成培養基是根據細胞生存所需物質的種類和數量,用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養基,如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分:氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。優點:標準化生產,組分和含量相對固定,成本低。缺點:缺少某些成分,不能全滿足體外細胞生長需要,只能維持細胞生存,要想使細胞生長和繁殖,還需補充一定量的天然培養基(如血清)。


          • 血清培養基

          血清中含有:①多種蛋白質(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等)②多種金屬離子③激素;④促貼附物質,如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉移蛋白⑦不明成分。


          常用血清:胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等,其中以胎牛血清質量為好。


          血清質量好壞是實驗成敗的關鍵,優質血清的標準:透明,淡黃色,無沉淀物,無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活(消除補體活性):56℃,30min。血清的消毒:過濾除菌。


          • 抗菌素的使用

          抗生素的作用:在培養液配制后,培養液內常加適量抗菌素,以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素最終使用濃度為每毫升100單位,方便、廣譜、穩定。

           

          • 完培的組成

          基礎培養基80%一95%,血清5%-20%,碳酸氫鈉2.0g/L,青、鏈霉素各100單位/毫升。



          四、細胞的傳代方式

          (1)懸浮細胞



          直接傳代法:懸浮細胞沉淀在瓶壁時,將上清培養液去除l/2-2/3,然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。


          離心法傳代:離心(1000 r/min)去上清,沉淀物加新培養液后再混勻傳代。


          (2)半懸浮細胞

          此類細胞部分呈現貼壁生長現象,但貼壁不牢,可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來,進行傳代。


          (3)貼壁細胞

          采用酶消化法傳代,常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。


          詳細步驟:

          1、吸光培養瓶中的培養基,加入1-2ml PBS清洗2-3遍,吸出PBS。

          2、加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液,以消化液能覆蓋整個瓶底為準。

          3、靜置2-10min(具體時間根據細胞狀態確定),顯微鏡下動態監測,當細胞消化全,立即加入含血清培養基,終止消化。

          4、轉移至離心管,離心(800r/min,5min)。

          5、吸去胰蛋白酶液,加入培養液,反復吹打細胞沉淀,混勻,形成細胞懸液。

          6、吸取適量細胞懸液,接種于新的培養瓶內。

          7、加適量新鮮培養液于接種了細胞懸液的新培養瓶內,然后放入培養箱中培養。



          五、細胞的凍存與復蘇



          (1)凍存和復蘇的原則


          慢凍快融,當細胞冷到0℃以下,可以產生以下變化:細胞器脫水,細胞中可溶性物質濃度升高,并在細胞內形成冰晶。如果緩慢冷凍,可使細胞逐步脫水,細胞內不致產生大的冰晶;相反結晶就大,大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重結晶。


          (2)慢凍程序

          方法一:當溫度在-25℃以上時,-1~-2℃/min;當溫度達-25℃以下時,-5~-10℃/min;當溫度達-100℃時,可迅速放入液氮中細胞凍存。


          方法二:冷凍管置于已設定程序之程序降溫機中每分鐘降-1~-3℃至-80℃以下,再放入液氮長期保存。


          方法三:購買無血清快速細胞凍存液,可以省掉程序降溫的步驟,直接凍存。補充:一般凍存液的配置:90%血清+10%DMSO。


          (3)基低溫保護劑的應用

          在細胞凍存時加入低溫保護劑,能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO,它是一種滲透性保護劑,可迅速透入細胞,提高胞膜對水的通透性,降低冰點,延緩凍結過程,能使細胞內水分在凍結前透出細胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內冰晶,從而減少冰晶對細胞的損傷。


          (4)細胞凍存步驟

          1、預先配制凍存液:含20%血清培養基10%DMSO

          2、取對數生長期細胞,經胰酶消化后,加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液(1×106~5×106細胞/ml)

          3、加入1ml細胞于凍存管中,密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。

          4、按照慢凍程序對細胞進行凍存。


          (5)細胞復蘇步驟

          1、從液氮中取出冷凍管,迅速投入37℃水浴鍋,使其融化(1分鐘左右)。

          2、立即轉移至離心管,加入適量培養液。

          3、以800r/min離心5分鐘。

          4、去上清,加新鮮培養液,吹打混勻成細胞懸液,轉移至培養瓶,放入培養箱培養。



          六、細胞計數

          (1)人工計數法

          吹打待測細胞懸液中細胞,使其在懸液內分布均勻,這樣只需測定很小一部分體積的細胞懸液中的細胞數目,即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。


          酒精消毒計數板:用酒精棉將細胞計數板和蓋玻片全擦拭干凈,并將蓋玻片蓋于細胞計數板上;


          轉移蓋玻片:吸取10 ul單細胞懸液,并沿著蓋玻片邊緣滴加,使細胞懸液填滿蓋玻片和計數板之間區域,注意避免產生氣泡,細胞懸液亦不能流入計數板的邊槽中,之后靜置3 min;


          數細胞:隨機選取計數板上其中4大格并記錄4大格中的細胞總數,壓線的細胞按照數上不數下,數左不數右的原則,之后按照以下公式進行計算:

          細胞數/mL=4大格細胞總數/4×104×稀釋倍數



          七、注意事項

          (1)注意事項

          計數前:計數前,注意吸盡培養皿里的細胞,充分混勻,使細胞分散成單個細胞。


          實驗操作臺:實驗操作應在操作臺中央無菌區域內進行,勿在邊緣非無菌區域操作。


          吸管:吸取過營養液后的吸管不能再用火焰燒灼,因殘留在吸管頭中營養液能燒焦形成炭膜,再用時會把有害物帶入營養液中。


          手:不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內部,吸管前部等所有可能與細胞接觸的部分,如已接觸,要用火焰燒灼消毒或取備品更換。


          火焰滅菌時間:開啟、關閉長有細胞的培養瓶時,火焰滅菌時間要短。防止因溫度過高燒死細胞。


          換液:換液時傾倒廢液,瓶口不能接觸廢液缸,速度不能過快,防止廢液四濺。


          吹打細胞:吹打細胞時,要注意邊角的細胞是否吹打下來。


          相對較臟的物品:手或相對較臟的物品不能經過開放的瓶口上,即不可以在開放容器上方操作。


          交叉污染:每次操作只處理一株細胞,以免造成細胞交叉污染。


          自身的安全:注意自身的安全,對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過程中,應避免引起氣溶膠的產生,小心有毒性試劑例如DMSO,并避免尖銳物品傷人等。


          凍存:從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存,但最好為對數生長期細胞。在凍存前一天最好換一次培養液。將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護工作,以免凍傷。凍存和復蘇最好用新配制的培養液。


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