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          Western Blot結果不理想怎么辦?

          發布時間: 2022-11-01  點擊次數: 215次

          1 簡述

          Western Blot(簡稱WB),蛋白質免疫印跡法,是基于蛋白質SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識別蛋白的特性,通過顯色技術,以達到檢測目的蛋白的技術。該技術廣泛應用于定性檢測蛋白水平的表達,活性分析與鑒定。該實驗步驟多,關鍵點多,耗時長,每個步驟可能都影響最終的結果,所以實驗中經常出現各種問題。本文對WB實驗中常出現的各種問題進行歸納總結,并給出相應的解決方法,以便了解WB實驗中的注意點和規范操作的必要性,同時對WB出現的問題分析和解決提供參考。

          2 實驗原理

          WB以組織或細胞中的蛋白質為研究對象,經過SDS-PAGE分離蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的一抗起免疫反應,再與酶或同位素標記的二抗起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

          3 實驗流程圖

          image.png

          WB實驗流程圖



          4 常見問題可能原因和解決辦法

          WB實驗步驟較多,耗時均較長,且每步都影響最終的結果表現。我們將常見問題總結歸納為5大類,見表4-1。下面將對各問題進行分類總結,并對出現該現象的原因進行分析,給出相應的解決辦法。

          表4-1 常見問題分類

          章節

          問題

          4.1

          無信號,沒有陽性條帶

          4.2

          有陽性條帶,但條帶信號弱

          4.3

          條帶或位置異常(微笑條帶;皺眉條帶;條帶變形;啞鈴條帶;條帶位置異常;條帶粘連)

          4.4

          高背景(均一性高背景;非均一性高背景)

          4.5

          非特異性條帶多

          4.6

          其它問題(目標條帶是空白,周圍有背景;條帶中間或周圍出現白影;非均一性背景)

           

          4.1 無信號,沒有陽性條帶

          WB結果中常出現白板或者條帶無信號響應現象,如圖4-1。我們針對出現該現象可能的原因主要從抗體,抗原,實驗操作和緩沖液幾方面進行分析。

          image.png




          4.1.1 抗體相關原因

          WB中所用到抗體包括一抗和二抗,在該問題上,兩個抗體方面可能存在的原因以及相對應的解決方法,歸納總結在表4-2中。

          表4-2 抗體相關原因

          可能原因

          解決辦法

          二抗選用不恰當

          選擇與一抗相匹配的二抗類型,二抗需和一抗宿主

          的物種相同,如圖4-2。

          無足夠量抗體結合目標蛋白

          降低一抗稀釋度;使用效價高的一抗;延長抗體孵育

          時間;膜充分浸潤在液體中。

          抗體不適用于western blot

          檢查數據庫看抗體是否可用于WB

          儲存時間較長或儲存條件不當導致抗體失活

          選擇在有效期內的抗體;工作液現配現用


          4.1.2 抗原相關原因

          抗原即所需要檢測目的蛋白,其相關原因可能是未被一抗識別或者是抗原量不足引起,相對應解決辦法見表4-3。

          表4-3 抗原相關原因

          可能原因

          解決辦法

          一抗不識別待檢測的目的蛋白

          參照數據庫對比抗原序列和蛋白序列,選擇合適一抗,確

          保會發生特異性反應

          抗原量不足或降解

          每條泳道上樣量不低于 20~30 ug, 使用蛋白酶抑制劑并設

          置陽性對照


          4.1.3 實驗操作相關原因

          實驗操作規范對于實驗結果也至關重要,且需要重復摸索。無條帶出現可能是目標蛋白未從膠轉移至膜上或者洗膜過度,具體分析見表4-4。

          表4-4 實驗操作相關原因

          可能原因

          解決辦法

          轉膜不充分

          使用麗春紅S染膜或使用考馬斯亮藍染膠檢測轉膜效果;檢查轉膜操作是否正確;優化電轉條件;使用兩張膜疊加載一起,防止轉膜過度,或者使用小孔徑膜

          洗膜次數過多

          減少洗膜次數,洗膜時間和溫度


          4.1.4 緩沖液相關原因

          實驗中用到多種緩沖液,緩沖液的選擇和保存,以及選擇合適的顯色方式都很重要。無目標蛋白出現可能與緩沖液有關的原因和解決方法見表4-5。

          表4-5 緩沖液相關原因

          可能原因

          解決辦法

          封閉液與一抗或二抗有交叉反應

          使用溫和的去污劑如Tween-20,或更換封閉液

          緩沖液中含有HRP抑制劑

          避免疊氮(dan)化鈉和HRP一起使用

          ECL發光液失活

          更換新的有效的發光液

          顯色方式選擇

          延長曝光和顯色時間;ECL 顯色比DAB顯色靈敏度

          高5-10倍。


          4.2 有陽性條帶,但條帶信號弱

          WB結果中可能出現有目標蛋白條帶,但是目標條帶在膜上顏色較淺,如圖4-3。該現象原因與4.1中無目標條帶較為相似,可能導致該現象的原因我們也從4個方面進行分析,并給出相應的解決方法,具體分析見表4-6。

          image.png

          圖4-3 條帶信號弱案例



          表4-6 條帶信號弱可能原因和解決方法

          問題所在

          可能原因

          解決辦法

          抗體相關

          抗體濃度過低

          提高抗體濃度

          抗體和抗原親和力較低

          提高抗體濃度


          抗體活性較低

          選擇在有效期內的抗體;工作液現配現用,避免在長時

          間內放置

          抗原相關

          抗原量不足

          檢查待測樣本,增加上樣量

           

           

          實驗操作相關

          轉膜不充分

          使用麗春紅S染膜或使用考馬斯亮藍染膠檢測轉膜效果;檢查轉膜操作是否正確;優化電轉條件;使用兩張膜疊加載一起,防止轉膜過度,或使用小孔徑膜

          抗體染色不充分

          增加抗體濃度;延長孵育時間

          洗膜過度

          縮短洗膜時間

          封閉過度

          減少封閉劑的量或縮短時間,換用不同封閉劑類型

          曝光時間過短

          增加曝光時間

          緩沖液相關

          可能含有HRP抑制劑

          避免疊氮鈉和HRP一起使用

           

          4.3 條帶或位置異常

          條帶或者位置異常是指條帶形狀異常和條帶在膜上與理論位置不一致。條帶形狀異常常與電泳問題有關,SDS-PAGE電泳的質量至關重要。條帶位置異??赡苁堑鞍壮霈F聚體或被修飾,蛋白出現降解有關。下面就可能出現的各個問題結合實際案例詳細討論。

          4.3.1 微笑條帶

          電泳條帶或整體出現 “︶ "形狀,如圖4-4和4-5,可能原因主要包括兩方面。一是電泳速度過快,可通過減少電壓等減慢電泳速度。二是電泳溫度過高,使得膠變形,可在冷室或者冰浴中進行電泳或者改變電泳pH。


          image.png

          4.3.2 皺眉條帶

          與微笑狀條帶相反,條帶成現“︵"皺眉狀,可能是由于裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡,或者兩邊聚合不全??赏ㄟ^調整裝置來避免該問題。如圖4-6。

          圖片

          圖4-6 皺眉條帶

          4.3.3 某條條帶變形

          WB結果中其它條帶均正常,某條條帶出現變形,如圖4-7所示,出現該現象可能的原因是SDS-PAGE膠中有氣泡或者不溶性顆粒。我們在配膠過程中要小心,使用無雜質的液體。


          圖片

          圖4-7 條帶變形

          4.3.4 啞鈴狀條帶

          結果中出現條帶呈現啞鈴狀,如圖4-8,該現象可能有兩個原因導致。一是由于配置膠有問題,膠凝固后不均一,可通過重新配置膠,確保膠質量無問題來避免該現象出現。二是樣品可能含有過多雜質,我們在樣品使用前對其進行離心,以去除過多雜質。


          圖片

          圖4-8 啞鈴狀條帶

          4.3.5 條帶粘連

          條帶粘連是不同孔目標條帶連在一起,中間無間隔,如圖4-9所示。出現該現象的原因可能是上樣量太多,或者是制膠問題,分離膠和濃縮膠之間有間隙,樣品竄孔??赏ㄟ^減少上樣量和提高配膠質量來避免該問題。


          圖片

          圖4-9 條帶粘連

          4.3.6 分子條帶大小不對

          分子條帶大小,即條帶位置異常,主要包括三種情況。第一種是出現高于目標蛋白較多的條帶,如圖4-10,該現象可能是由于蛋白未充分變性,導致蛋白形成二聚體或者多聚體。為避免該現象,可在實驗之前加入新配的DTT或?-ME,重新加熱使得蛋白充分變性或者直接使用新的蛋白樣本。第二種是出現略高于目標蛋白的條帶,如圖4-11,該現象可能是由于蛋白被修飾,如糖基化/磷酸化等,可導致分子量增加。解決方法是嘗試使用酶去除可能的蛋白修飾。第三種是出現比目標蛋白略低的條帶,如圖4-12,該現象可能是由于蛋白翻譯后剪切或者降解。在樣品準備時候要在冰上操作或者是加入更過蛋白酶抑制劑,以防止蛋白降解。


          image.png

          4.4 高背景

          高背景是WB中常出現的問題,本文將高背景分為兩類討論,包括均一性高背景和斑點或發泡式或閃爍式非均一性高背景。下面針對兩種情況均從抗體,實驗操作和緩沖液方面進行分析討論,并給出相應的解決方法,以減少背景,得到漂亮真實可靠的WB結果。

          4.4.1 均一性高背景

          均一性高背景在實驗中常常出現,如圖4-13,可能導致該現象的原因較多,均總結于表4-7中,并給出相應的解決方法。

           

          圖片

          圖4-13 均一性高背景


          表4-7 均一性高背景原因和解決方法

          問題所在

          可能原因

          解決辦法

           

           

          抗體相關

          一抗,二抗濃度較高

          提高一抗,二抗稀釋度,優化稀釋條件

          一抗,二抗和封閉液結合

          更換封閉液;更換二抗或降低二抗濃度

          儲存時間較長或儲存條件不當導致抗體失活

          選擇新的抗體

           

           

           

           

          實驗操作相關

          封閉溫度過高,封閉不全

          封閉液的選擇與優化;使用5%脫脂奶粉封

          閉;優化封閉時間和溫度

          膜的問題

          防止膜過程中干燥;換用NC膜進行實驗;

          使用干凈鑷子并戴手套操作

          孵育中洗膜不充分

          適當增加洗膜時間和次數;確保在充分震蕩

          的條件下孵育膜,并且抗體充分覆蓋膜表面

          曝光過度

          縮短曝光時間,或等5~10分鐘后重新使用

          X光片進行曝光

           

          緩沖液相關

          緩沖液中去污劑不夠

          增加TBST中Tween 20的濃度

          轉膜液,封閉液等不新鮮或被污染

          現用現配


          4.4.2 斑點或發泡式或閃爍式非均一性高背景

          出現非均一性高背景結果的原因與均一性背景有很多相似之處,也存在差別,如蛋白聚體的影響,非均一性高背景案例圖如圖4-14所示,可能原因見表4-8。

          圖片

          圖4-14 非均一性高背景


          表4-8 非均一性高背景原因和解決方法

          問題所在

          可能原因

          解決辦法

          抗體相關

          抗體濃度太高

          提高一抗,二抗稀釋度,優化稀釋條件

          二抗聚集

          使用前過濾二抗或者更換二抗

          封閉劑中有聚集體

          使用前過濾封閉劑或者更換

          一抗,二抗和封閉液結合

          更換封閉液;更換二抗或降低二抗濃度

          實驗操作相關

          封閉溫度過高,封閉不全

          封閉液的選擇與優化;增加封閉液中蛋白濃度;優

          化封閉時間和溫度

          膜沒有正確潤濕

          使用干凈鑷子并戴手套操作;使用足夠液體,膜始

          終保持濕潤;孵育時使用脫色搖床;避免膜重疊,

          相互覆蓋

          緩沖液相關

          儀器污染

          保證所有儀器和用具干凈;確保膜上無殘留膠

          轉膜液,封閉液等不新鮮或被污染

          現用現配

           

          4.5 非特異性條帶多

          非特異性條帶是指除目標蛋白以外的條帶,雜帶較多影響結果判斷,且結果不可靠。下面我們結合實際案例對其可能原因進行分析,并找出相對應的解決方法,見表4-9。

          圖片


          表4-9 非特異性條帶多可能原因和解決方法

          可能原因

          解決方法

          抗體稀釋度問題,如圖4-15。

          降低上樣量;提高一抗稀釋度。

          抗體未純化

          使用單克隆或親和層析純化后的抗體,減少非

          特異條帶

          轉膜強度太強,導致雜帶太強,如圖4-16。

          降低轉膜強度(時間和電流),使目標蛋白上

          方的蛋白少轉移到膜上。

          抗體與蛋白非特異性結合,如圖4-17。

          更換抗體

          封閉不全

          增加封閉液中蛋白濃度

          細胞傳代次數過多,導致其蛋白表達模式分化

          使用原代或者傳代少的細胞株,和現在的細胞

          株一起做參照

          新蛋白或同族蛋白分享同種表位的不同剪接方式

          查其文獻報導,或BLAST查詢,使用說明書報

          導的細胞株或組織


          image.png

          4.6 其它問題

          4.6.1 反白現象

          反白現象是蛋白條帶中間空白,而周圍背景正常,如圖4-18所示。該現象可能原因是一抗濃度過高,二抗上HRP催化活力太強,同時顯色底物處于臨界點,反應時間不長,將周圍底物催化完,形成了空白??山档鸵豢购投節舛?,或者更換底物來避免該現象。


          圖片

          圖4-18 反白現象

           

          4.6.2 條帶中間或周圍出現白圈

          條帶中間白圈(如圖4-19)可能是由于電轉中膜和膠之間存在氣泡。在轉膜過程中要盡量去除氣泡,使膜,濾紙和膠緊密結合。同時,抗體孵育的過程中,保持膜的充分浸潤。


          圖片

          圖4-19 條帶中間白圈

           

           


          后記

          WB因結果直觀易分析為蛋白研究中最為常用的方法之一,但也因為其步驟繁雜結果變幻莫測成為很多新手的夢魘。相信看完本文的小伙伴一定會有所感悟,把握好基本原則:先做出條帶,再優化結果。好看的結果千篇一律,有趣的條帶五花八門,且把它們看作是枯燥科研中的小點綴吧~


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